Jedním z hlavních cílů mé diplomové práce je provést totální syntézu genu TEV proteasy, a to pomocí komerčně získaných oligonukleotidů.
Dalším bodem je optimalizovat podmínky produkce rekombinantní TEV proteasy a pro získaný protein nalézt co nejvhodnější purifikační postup s použitím různých druhů chromatografií, jako je afinitní chromatografie na imobilizovaných iontech kovů, chromatografie na iontoměničích či gelová permeační chromatografie.
Nakonec je potřeba stanovit kinetické parametry (KM, kcat) jak získané, tak komerčně dodávané TEV proteasy a výsledky z obou enzymových kinetik vzájemně porovnat.
Anotace v angličtině
One of chief aims of my diploma work is make total gene synthesis of TEV protease by means of commercially available oligonucleotides.
Another point is optimize conditions for production of recombinant TEV protease and find most suitable purification procedure for the obtained protein with using different kinds of chromatographies, such as immobilized metal affinity chromatography, ion exchange chromatography or gel permeation chromatography.
Last point is determine kinetic parameters (KM, kcat) both obtained and commercially available TEV protease and compare the results of both enzymatic kinetics.
Klíčová slova
TEV proteasa, oligonukleotidy, purifikace proteinu, chromatografie, kinetické parametry
Klíčová slova v angličtině
TEV protease, oligonucleotides, protein purification, chromatography, kinetic parameters
Rozsah průvodní práce
112 s., 3 s. obr. příloh
Jazyk
CZ
Anotace
Jedním z hlavních cílů mé diplomové práce je provést totální syntézu genu TEV proteasy, a to pomocí komerčně získaných oligonukleotidů.
Dalším bodem je optimalizovat podmínky produkce rekombinantní TEV proteasy a pro získaný protein nalézt co nejvhodnější purifikační postup s použitím různých druhů chromatografií, jako je afinitní chromatografie na imobilizovaných iontech kovů, chromatografie na iontoměničích či gelová permeační chromatografie.
Nakonec je potřeba stanovit kinetické parametry (KM, kcat) jak získané, tak komerčně dodávané TEV proteasy a výsledky z obou enzymových kinetik vzájemně porovnat.
Anotace v angličtině
One of chief aims of my diploma work is make total gene synthesis of TEV protease by means of commercially available oligonucleotides.
Another point is optimize conditions for production of recombinant TEV protease and find most suitable purification procedure for the obtained protein with using different kinds of chromatographies, such as immobilized metal affinity chromatography, ion exchange chromatography or gel permeation chromatography.
Last point is determine kinetic parameters (KM, kcat) both obtained and commercially available TEV protease and compare the results of both enzymatic kinetics.
Klíčová slova
TEV proteasa, oligonukleotidy, purifikace proteinu, chromatografie, kinetické parametry
Klíčová slova v angličtině
TEV protease, oligonucleotides, protein purification, chromatography, kinetic parameters
Zásady pro vypracování
1. Vypracujte literární rešerši na zadané téma s využitím dostupných databází (Web of Science, PubMed, Current Content) a dalších dostupných materiálů.
2. Pokuste se o totální syntézu genu TEV proteasy pomocí komerčně získaných oligonukleotidů.
3. S využitím komerčně získaného plazmidu připravte expresní vektor obsahující žádaný gen a transformujte jím vhodný kmen E. coli.
4. Optimalizujte podmínky produkce TEV proteasy, podle časových možností vyzkoušejte koexpresi TEV proteasy s molekulárními chaperony E. coli případně další postupy vedoucí k vyššímu výtěžku žádaného proteinu v nativní formě.
5. Funkčnost získané TEV proteasy se pokuste vhodným způsobem ověřit.
6. Veškerá naměřená data zpracujte přehledně písemnou formou, výsledky (s výhodou) znázorněte pomocí tabulek a grafů s využitím počítače a dostupného programového vybavení.
Zásady pro vypracování
1. Vypracujte literární rešerši na zadané téma s využitím dostupných databází (Web of Science, PubMed, Current Content) a dalších dostupných materiálů.
2. Pokuste se o totální syntézu genu TEV proteasy pomocí komerčně získaných oligonukleotidů.
3. S využitím komerčně získaného plazmidu připravte expresní vektor obsahující žádaný gen a transformujte jím vhodný kmen E. coli.
4. Optimalizujte podmínky produkce TEV proteasy, podle časových možností vyzkoušejte koexpresi TEV proteasy s molekulárními chaperony E. coli případně další postupy vedoucí k vyššímu výtěžku žádaného proteinu v nativní formě.
5. Funkčnost získané TEV proteasy se pokuste vhodným způsobem ověřit.
6. Veškerá naměřená data zpracujte přehledně písemnou formou, výsledky (s výhodou) znázorněte pomocí tabulek a grafů s využitím počítače a dostupného programového vybavení.
Seznam doporučené literatury
-
Seznam doporučené literatury
-
Přílohy volně vložené
-
Přílohy vázané v práci
grafy, schémata, tabulky
Převzato z knihovny
Ano
Plný text práce
Přílohy
Posudek(y) oponenta
Hodnocení vedoucího
Záznam průběhu obhajoby
Diplomant odpověděl na dotazy uvedené v recenzním posudku a odpověděl na dotazy, které mu položili členové komise.