V posledních deseti letech se tkáňové inženýrství a regenerativní medicína velmi aktivně věnuje scaffoldům, které mají 3dimensionální strukturu pro lepší podporu obnovy tkáně. Scaffoldové struktury navíc mohou být připraveny podle potřeby regenerace jak pro tuhé, tak pro měkké tkáně. Tuhé tkáně v podstatě představují kostní kompozity, které mají organickou matrici vyztuženou anorganickými minerály ve formě hybridní struktury. Relativně novým konceptem ve vývoji scaffoldů pro tyto tuhé tkáně je tvorba tzv. biomimikrů, které se formují v matrici biomineralizací. Matrici v těchto případech většinou představuje biomateriál, ve kterém vyrůstá krystalická struktura minerálů. Z množství dostupných biomateriálů jsou upřednostňovány hydrogely, a to zejména pro schopnost absorbovat velké množství kapalin a vytvářet příznivé prostředí pro regeneraci živé tkáně.
Předkládaná doktorská práce se zaměřuje na výzkum možností biomimetické přípravy scaffoldů mineralizačním procesem v hydrogelové matrici. Za optimální matrici byla zvolena směs PVP-CMC hydrogelů, do které byly difusním procesem vpraveny vodní roztoky Na2CO3 a CaCl2. Byla navržena a připravena řada mineralizovaných vzorků s rozdílnou koncentrací pro hodnocení biomimetického procesu, tvorby krystalické minerální struktury a vlastností vzniklého scaffoldu. Nově vzniklé struktury scaffoldů byly označeny jako "Biomineralizovaný (CaCO3) PVP-CMC hydrogel".
Identifikace přítomnosti skupiny -CO3 ve struktuře hydrogelu a tím potvrzení úspěšnosti procesu biomineralizace byla provedena metodou FTIR, která zjistila přítomnost peaků 1405cm-1 a 871cm-1. Metodou XRD pak byla identifikována přítomnost kalcitu v porézní struktuře PVP-CMC hydrogelu. Morfologické hodnocení biomineralizované struktury bylo provedeno pomocí SEM, které ukázalo, že se distribuce mikropórů ve struktuře hydrogelu pohybuje v rozmezí od 1 do 170 mikrometrů.
Zaplněnost pórů kalcitem pak byla stanovena měřením hustoty vzorků v relaci k neplněnému systému. Informace o skladbě scaffoldového systému byly doplněny pomocí měření na TGA. Viskoelastické vlastnosti připravených systémů byly měřeny standardním postupem na rotačním reometru Ares. U vzorků byla posuzována komplexní viskozita a soufázový a ztrátový modul. S intenzivnějším biomineralizačním procesem se podle očekávání snižovaly parametry stanovující elastický podíl mineralizovaného scaffoldu, a zvyšovaly hodnoty určující viskozní vlastnosti. Mineralizované scaffoldy navíc vykazovaly obtížnější deformovatelnost při zatížení v relaci k neplněným hydrogelům, což může mít v praxi vliv na způsob aplikace tuhých biomineralizovaných scaffoldů.
Dále byly studovány podmínky, které mohou ovlivňovat regenerační účinnost mineralizovaných scaffoldů. Scaffoldy byly posuzovány podle nasákavosti roztoků simulujících biologické tekutiny, které obsahovaly např. glukózu, močovinu či fyziologický roztok. Experimenty byly prováděny za fyziologicky relevantních podmínek. Hodnocení bylo prováděno podle poměrného narůstání objemu scaffoldu a bylo zjištěno, že nejvyšší schopnost nasávat má močovinový roztok, následovaný roztokem fyziologickým. Roztok obsahující glukózu pak prokázal nejnižší stupeň nasákavosti. Konečně pak byly provedeny počáteční experimenty hodnotící cytotoxicitu. Byly použity fibroblasty myších embryonálních tkání umístěné do biomineralizovaného scaffoldu po dobu 24, 48 a 72 hodin a buňky MG 63 Osteosarcoma po dobu 1 až 7 dnů. Životnost obou druhů buněk dosahovala více než 80% což prokazuje, že nový typ biomineralizovaného scaffoldu (PVP-CMC-CaCO3) má netoxický character.
Annotation in English
In the last decade, tissue engineering and regenerative medicine actively focus on scaffolds which have a three dimensional structure for a better regeneration of tissue. Depending on the type of regeneration needed, the scaffolds can be prepared for both hard and soft tissues. Hard tissues are basically represented by bone composites containing organic matrix reinforced by inorganic minerals in the form of a hybrid structure. A relatively new concept in the development of scaffolds for the hard tissues is the formation of Biomimicry formed in the matrix through biomineralization. In these cases, the matrix is mostly represented by a biomaterial in which the crystal structure of minerals grows. From many available biomaterials hydrogels are preferred especially due to their ability to store large amount of liquid and create environment favourable for regeneration of living tissue.
The current doctoral thesis focuses on a research of establishing possible ways of biomimetic preparation of scaffolds through a mineralization process in the hydrogel matrix. Through a simple liquid diffusion technique, aqueous solutions of Na2CO3 and CaCl2 were incorporated into the blend of PVP-CMC hydrogels, which was chosen to be an ideal matrix. A number of mineralized samples was proposed and prepared - differing in strength of concentration of the biomimetic process, formation of mineral crystal structure and different characteristics of the formed scaffold structure. These newly formed scaffold structures were named "Biomineralized (CaCO3) PVP-CMC hydrogel."
Identifying the -CO3 presence in the hydrogel structure, and thereby confirming the success of the biomineralization process was carried out by the FTIR method, which encountered the peaks at 1405cm-1 and 871cm-1. XRD method then identified the calcite in the porous structure of PVP-CMC hydrogel. Morphological evaluation of the biomineralized structure through the SEM analysis proved that the micro-pores distribution within the hydrogel structure appeared in the range of 1-170 micrometres.
The level to which the pores were filled up by the calcite was evaluated by measurement of density of the samples in relation to non-filled system. Information about the composition of the scaffold system was added by the TGA measurement. Viscoelastic properties of the prepared systems were measured using parallel plate rheometer (ARES), where complex viscosity, storage and loss moduli were evaluated. As per the expectations, the more intense the biomineralization process was, the lower the parameters determining the share of elasticity of the mineralized scaffold were and the higher the values determining the viscous properties. On top of that, mineralized scaffolds showed more difficulties to deformation in load in relation to non-filled hydrogels which can influence the ways of application of hard biomineralized scaffolds.
Further, the conditions influencing the regeneration effectivity of mineralized scaffolds were investigated. The scaffolds were evaluated from the points of view of swelling ability of biological solutions containing glucose, urea and physiological solutions. Experiments were carried out under physiologically relevant conditions. Evaluation was done based on relative increase of volume of the scaffold. The highest swelling ability was in the presence of urea solution followed by the physiological solution. Glucose solution had the least swelling ability. Eventually, the starting experiments evaluating cytotoxicity were carried out. Mouse embryonic fibroblasts were placed into the biomineralized scaffold for 24, 48 and 72 hours and also MG 63 Osteosarcoma cells were retained for 1 and 7 day period. However, viability with both the cells reached more than 80% which proves that the new type of biomineralized scaffold is of non-toxic nature.
V posledních deseti letech se tkáňové inženýrství a regenerativní medicína velmi aktivně věnuje scaffoldům, které mají 3dimensionální strukturu pro lepší podporu obnovy tkáně. Scaffoldové struktury navíc mohou být připraveny podle potřeby regenerace jak pro tuhé, tak pro měkké tkáně. Tuhé tkáně v podstatě představují kostní kompozity, které mají organickou matrici vyztuženou anorganickými minerály ve formě hybridní struktury. Relativně novým konceptem ve vývoji scaffoldů pro tyto tuhé tkáně je tvorba tzv. biomimikrů, které se formují v matrici biomineralizací. Matrici v těchto případech většinou představuje biomateriál, ve kterém vyrůstá krystalická struktura minerálů. Z množství dostupných biomateriálů jsou upřednostňovány hydrogely, a to zejména pro schopnost absorbovat velké množství kapalin a vytvářet příznivé prostředí pro regeneraci živé tkáně.
Předkládaná doktorská práce se zaměřuje na výzkum možností biomimetické přípravy scaffoldů mineralizačním procesem v hydrogelové matrici. Za optimální matrici byla zvolena směs PVP-CMC hydrogelů, do které byly difusním procesem vpraveny vodní roztoky Na2CO3 a CaCl2. Byla navržena a připravena řada mineralizovaných vzorků s rozdílnou koncentrací pro hodnocení biomimetického procesu, tvorby krystalické minerální struktury a vlastností vzniklého scaffoldu. Nově vzniklé struktury scaffoldů byly označeny jako "Biomineralizovaný (CaCO3) PVP-CMC hydrogel".
Identifikace přítomnosti skupiny -CO3 ve struktuře hydrogelu a tím potvrzení úspěšnosti procesu biomineralizace byla provedena metodou FTIR, která zjistila přítomnost peaků 1405cm-1 a 871cm-1. Metodou XRD pak byla identifikována přítomnost kalcitu v porézní struktuře PVP-CMC hydrogelu. Morfologické hodnocení biomineralizované struktury bylo provedeno pomocí SEM, které ukázalo, že se distribuce mikropórů ve struktuře hydrogelu pohybuje v rozmezí od 1 do 170 mikrometrů.
Zaplněnost pórů kalcitem pak byla stanovena měřením hustoty vzorků v relaci k neplněnému systému. Informace o skladbě scaffoldového systému byly doplněny pomocí měření na TGA. Viskoelastické vlastnosti připravených systémů byly měřeny standardním postupem na rotačním reometru Ares. U vzorků byla posuzována komplexní viskozita a soufázový a ztrátový modul. S intenzivnějším biomineralizačním procesem se podle očekávání snižovaly parametry stanovující elastický podíl mineralizovaného scaffoldu, a zvyšovaly hodnoty určující viskozní vlastnosti. Mineralizované scaffoldy navíc vykazovaly obtížnější deformovatelnost při zatížení v relaci k neplněným hydrogelům, což může mít v praxi vliv na způsob aplikace tuhých biomineralizovaných scaffoldů.
Dále byly studovány podmínky, které mohou ovlivňovat regenerační účinnost mineralizovaných scaffoldů. Scaffoldy byly posuzovány podle nasákavosti roztoků simulujících biologické tekutiny, které obsahovaly např. glukózu, močovinu či fyziologický roztok. Experimenty byly prováděny za fyziologicky relevantních podmínek. Hodnocení bylo prováděno podle poměrného narůstání objemu scaffoldu a bylo zjištěno, že nejvyšší schopnost nasávat má močovinový roztok, následovaný roztokem fyziologickým. Roztok obsahující glukózu pak prokázal nejnižší stupeň nasákavosti. Konečně pak byly provedeny počáteční experimenty hodnotící cytotoxicitu. Byly použity fibroblasty myších embryonálních tkání umístěné do biomineralizovaného scaffoldu po dobu 24, 48 a 72 hodin a buňky MG 63 Osteosarcoma po dobu 1 až 7 dnů. Životnost obou druhů buněk dosahovala více než 80% což prokazuje, že nový typ biomineralizovaného scaffoldu (PVP-CMC-CaCO3) má netoxický character.
Annotation in English
In the last decade, tissue engineering and regenerative medicine actively focus on scaffolds which have a three dimensional structure for a better regeneration of tissue. Depending on the type of regeneration needed, the scaffolds can be prepared for both hard and soft tissues. Hard tissues are basically represented by bone composites containing organic matrix reinforced by inorganic minerals in the form of a hybrid structure. A relatively new concept in the development of scaffolds for the hard tissues is the formation of Biomimicry formed in the matrix through biomineralization. In these cases, the matrix is mostly represented by a biomaterial in which the crystal structure of minerals grows. From many available biomaterials hydrogels are preferred especially due to their ability to store large amount of liquid and create environment favourable for regeneration of living tissue.
The current doctoral thesis focuses on a research of establishing possible ways of biomimetic preparation of scaffolds through a mineralization process in the hydrogel matrix. Through a simple liquid diffusion technique, aqueous solutions of Na2CO3 and CaCl2 were incorporated into the blend of PVP-CMC hydrogels, which was chosen to be an ideal matrix. A number of mineralized samples was proposed and prepared - differing in strength of concentration of the biomimetic process, formation of mineral crystal structure and different characteristics of the formed scaffold structure. These newly formed scaffold structures were named "Biomineralized (CaCO3) PVP-CMC hydrogel."
Identifying the -CO3 presence in the hydrogel structure, and thereby confirming the success of the biomineralization process was carried out by the FTIR method, which encountered the peaks at 1405cm-1 and 871cm-1. XRD method then identified the calcite in the porous structure of PVP-CMC hydrogel. Morphological evaluation of the biomineralized structure through the SEM analysis proved that the micro-pores distribution within the hydrogel structure appeared in the range of 1-170 micrometres.
The level to which the pores were filled up by the calcite was evaluated by measurement of density of the samples in relation to non-filled system. Information about the composition of the scaffold system was added by the TGA measurement. Viscoelastic properties of the prepared systems were measured using parallel plate rheometer (ARES), where complex viscosity, storage and loss moduli were evaluated. As per the expectations, the more intense the biomineralization process was, the lower the parameters determining the share of elasticity of the mineralized scaffold were and the higher the values determining the viscous properties. On top of that, mineralized scaffolds showed more difficulties to deformation in load in relation to non-filled hydrogels which can influence the ways of application of hard biomineralized scaffolds.
Further, the conditions influencing the regeneration effectivity of mineralized scaffolds were investigated. The scaffolds were evaluated from the points of view of swelling ability of biological solutions containing glucose, urea and physiological solutions. Experiments were carried out under physiologically relevant conditions. Evaluation was done based on relative increase of volume of the scaffold. The highest swelling ability was in the presence of urea solution followed by the physiological solution. Glucose solution had the least swelling ability. Eventually, the starting experiments evaluating cytotoxicity were carried out. Mouse embryonic fibroblasts were placed into the biomineralized scaffold for 24, 48 and 72 hours and also MG 63 Osteosarcoma cells were retained for 1 and 7 day period. However, viability with both the cells reached more than 80% which proves that the new type of biomineralized scaffold is of non-toxic nature.
