Biokonjugační reakce jsou dlouhodobě používané k značení biomolekul pomocí
fluorescenčních značek, které spojují různé biomolekuly k sobě za vzniku různých povrchů nebo mikroskopických korálků. Během několika desetiletí výzkumu byly vyvinuty metody, které nám umožňují konjugovat různé funkční skupiny různých molekul při mírných změnách reakčních podmínek. Cílem této práce je představit některé z těchto technik a optimalizovat obecně používané metody pro naše specifické účely. Proto jsme zvolili dvě fluorescenční barviva, eosin Y a fluorescein, a pokusili se optimalizovat podmínky jejich konjugace k ethylendiaminu a N-hydroxylsukcimidu za použití moderního karbodiimidu, kondenzační reakcí s N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride jako kondenzačním činidlem. Reakce byly sledovány pomocí separace agarózovou elektroforézou s následnou fluorescenční detekcí. Tato metoda ukázala očekávaný průběh obou reakcí. Pokus o prokázání reakčního produktu hmotnostní spektrometrií (MS) však selhal, nejspíše z technických důvodů, které je třeba v budoucnu vyřešit. V případě pozdějšího potvrzení syntetizovaného produktu MS, jak produkty, tak optimalizované metody budou použity pro fluorescenční značení biomolekul, které jsou v našem zájmu, a jejich konjugace s polystyrénovými mikročásticemi za účelem manipulace pomocí
optických pinzet.
Annotation in English
Bioconjugation reactions have been long time used to labeling the biomolecules
By fluorescent marks, connecting different biomolecules to each other, attaching them to various surfaces or microscopic beads. During several decades of research manifold of methods have been developed that allow us to conjugate various functional groups of different molecules at mild reaction conditions with higher or lower specificity. The aim of this thesis is to introduce several of these techniques to our laboratory and to optimize the generally used methods for our specific purposes. Therefore, we chose two fluorescent dyes, eosin Y and fluorescein, and tried to optimize the conditions of their conjugation to ethylendiamine and N-hydroxylsuccimide using the carbodiimide moderat-ed condenzetion reaction with N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochlo-ride as the condensation agent. The reactions were monitored by means of the separation by agarose electrophoresis with fluorescent detection. This method showed the expected performance of both the reactions. However, the attempt to prove the reaction product by mass spectrometry (MS) failed, most likely due to the technical reasons that have to be solved in the future. In case of later confirmation of the synthesized product by MS both the products and the optimized methods will be used for fluorescent labeling of biomole-cules of our interest and their conjugation to polystyrene microparticles for the purpose
of manipulation by optical tweezers.
electrophoresis, mass spectrometer, optical tweezers, eosin, fluorescein
Length of the covering note
62 s. (7 960 slov)
Language
CZ
Annotation
Biokonjugační reakce jsou dlouhodobě používané k značení biomolekul pomocí
fluorescenčních značek, které spojují různé biomolekuly k sobě za vzniku různých povrchů nebo mikroskopických korálků. Během několika desetiletí výzkumu byly vyvinuty metody, které nám umožňují konjugovat různé funkční skupiny různých molekul při mírných změnách reakčních podmínek. Cílem této práce je představit některé z těchto technik a optimalizovat obecně používané metody pro naše specifické účely. Proto jsme zvolili dvě fluorescenční barviva, eosin Y a fluorescein, a pokusili se optimalizovat podmínky jejich konjugace k ethylendiaminu a N-hydroxylsukcimidu za použití moderního karbodiimidu, kondenzační reakcí s N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride jako kondenzačním činidlem. Reakce byly sledovány pomocí separace agarózovou elektroforézou s následnou fluorescenční detekcí. Tato metoda ukázala očekávaný průběh obou reakcí. Pokus o prokázání reakčního produktu hmotnostní spektrometrií (MS) však selhal, nejspíše z technických důvodů, které je třeba v budoucnu vyřešit. V případě pozdějšího potvrzení syntetizovaného produktu MS, jak produkty, tak optimalizované metody budou použity pro fluorescenční značení biomolekul, které jsou v našem zájmu, a jejich konjugace s polystyrénovými mikročásticemi za účelem manipulace pomocí
optických pinzet.
Annotation in English
Bioconjugation reactions have been long time used to labeling the biomolecules
By fluorescent marks, connecting different biomolecules to each other, attaching them to various surfaces or microscopic beads. During several decades of research manifold of methods have been developed that allow us to conjugate various functional groups of different molecules at mild reaction conditions with higher or lower specificity. The aim of this thesis is to introduce several of these techniques to our laboratory and to optimize the generally used methods for our specific purposes. Therefore, we chose two fluorescent dyes, eosin Y and fluorescein, and tried to optimize the conditions of their conjugation to ethylendiamine and N-hydroxylsuccimide using the carbodiimide moderat-ed condenzetion reaction with N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochlo-ride as the condensation agent. The reactions were monitored by means of the separation by agarose electrophoresis with fluorescent detection. This method showed the expected performance of both the reactions. However, the attempt to prove the reaction product by mass spectrometry (MS) failed, most likely due to the technical reasons that have to be solved in the future. In case of later confirmation of the synthesized product by MS both the products and the optimized methods will be used for fluorescent labeling of biomole-cules of our interest and their conjugation to polystyrene microparticles for the purpose
of manipulation by optical tweezers.
electrophoresis, mass spectrometer, optical tweezers, eosin, fluorescein
Research Plan
Vypracujte rešerši na téma principu a použití optické pasti (pinzety).
V rešerši popište rovněž biokonjugační chemické reakce sloužící k navazování fluorescenčních značek a polystyrenových mikročástic k biomolekulám.
Navrhněte experimentální postup navázání zvolené biomolekuly ke konjugačním partnerům (fluorescenčním značkám nebo mikročásticím).
Experimentálně proveďte zvolenou biokonjugační reakci, charakterizujte produkt a popište postup práce tak, aby mohl být nadále rutinně využíván.
Research Plan
Vypracujte rešerši na téma principu a použití optické pasti (pinzety).
V rešerši popište rovněž biokonjugační chemické reakce sloužící k navazování fluorescenčních značek a polystyrenových mikročástic k biomolekulám.
Navrhněte experimentální postup navázání zvolené biomolekuly ke konjugačním partnerům (fluorescenčním značkám nebo mikročásticím).
Experimentálně proveďte zvolenou biokonjugační reakci, charakterizujte produkt a popište postup práce tak, aby mohl být nadále rutinně využíván.
Recommended resources
Peterman, E.J.G. (Ed.) Single Molecule Analysis, Methods and Protocols, Second edition, Humana Press, New York, 2018.
Kubitschek, U. (Ed.) Fluorescence Microscopy, From Principles to Biological Applications, Second edition, Wiley-VCH, Weinheim, 2017.
Anderssson, M., Construction of force measuring optical tweezers instrumentation and investigations of biophysical properties of bacterial adhesion organelles, First edition, Print & Media, Umea, 2007.
Hermanson, T. G., Biokonjugate techniques, Third edition, Academic Press, London, 2013.
Recommended resources
Peterman, E.J.G. (Ed.) Single Molecule Analysis, Methods and Protocols, Second edition, Humana Press, New York, 2018.
Kubitschek, U. (Ed.) Fluorescence Microscopy, From Principles to Biological Applications, Second edition, Wiley-VCH, Weinheim, 2017.
Anderssson, M., Construction of force measuring optical tweezers instrumentation and investigations of biophysical properties of bacterial adhesion organelles, First edition, Print & Media, Umea, 2007.
Hermanson, T. G., Biokonjugate techniques, Third edition, Academic Press, London, 2013.
