gama-laktamasa je enzym, který dokáže štěpit pětičlenné laktamové cykly. Jeho potenciálním substrátem je polyvinylpyrrolidon (PVP). PVP je obsažen ve větším množství v odpadních vodách, a proto je gama-laktamasa zkoumána také pro následné využití k jejich čištění. Cílem této bakalářské práce bylo přípravit bakteriální expresní systémy rekombinantní gama-laktamasy. Gen pro enzym gama-laktamasy byl již dříve nasyntetizován. Byla provedena pouze PCR enzymu s his-tagem a primery, obsahující restrikční místa. Dále byly provedeny metody k dosažení čistšího produktu. Inserty byly rozštěpeny restrikčními endonukleasami a pomocí DNA ligasy byla provedena ligace do vektorů pET22b a pUC19. Těmito upravenými vektory byly následně transformovány kompetentní bakteriální buňky Escherichia coli DH5-alpha. Pro ověření přítomnosti insertu bylo opět provedeno restrikční štěpení endonukleasami a sekvence jednotlivých klonů byla ověřena sekvenční analýzou. Rekombinantní gama-laktamasou byly transformovány expresní buňky Escherichia coli BL21(DE3)RIL. Byla otestována exprese rekombinantní gama-laktamasy a provedeny pokusy o její izolaci a stanovení aktivity.
Annotation in English
gama-laktamase is an enzyme, which can split five-membered lactam cycles. Polyvinylpyrrolidon (PVP) is a potential substrate of this enzyme. PVP is contained in wastewater, which is one of the reasons, why gama-lactamase is studied. The goal of this work is to prepare a bacterial expression systems of recombinant gama-lactamase. A gene of gama-lactamase was synthesized earlier. PCR was performed with primers containing C-terminal His-tag and restriction sites for cloning . PCR product was isolated and inserts were cleaved by restriction endonucleases and ligated by DNA ligase to the vector pET22b and pUC19. Competent bacterial cells Escherichia coli DH5-alpha were transformed with these vectors. Presence of the insert was checked by cleavage by restriction endonucleases and the sequence was verified by sequencing analysis. Expression cells Escherichia coli BL21(DE3)RIL were transformed by expression plasmids containind the gene of the recombinant gama-lactamase. The expression of recombinant gama-lactamase was tested.
Keywords
gama-laktamasa, Polyvinylpyrrolidon, bakteriální expresní systém, aktivita
gama-laktamasa je enzym, který dokáže štěpit pětičlenné laktamové cykly. Jeho potenciálním substrátem je polyvinylpyrrolidon (PVP). PVP je obsažen ve větším množství v odpadních vodách, a proto je gama-laktamasa zkoumána také pro následné využití k jejich čištění. Cílem této bakalářské práce bylo přípravit bakteriální expresní systémy rekombinantní gama-laktamasy. Gen pro enzym gama-laktamasy byl již dříve nasyntetizován. Byla provedena pouze PCR enzymu s his-tagem a primery, obsahující restrikční místa. Dále byly provedeny metody k dosažení čistšího produktu. Inserty byly rozštěpeny restrikčními endonukleasami a pomocí DNA ligasy byla provedena ligace do vektorů pET22b a pUC19. Těmito upravenými vektory byly následně transformovány kompetentní bakteriální buňky Escherichia coli DH5-alpha. Pro ověření přítomnosti insertu bylo opět provedeno restrikční štěpení endonukleasami a sekvence jednotlivých klonů byla ověřena sekvenční analýzou. Rekombinantní gama-laktamasou byly transformovány expresní buňky Escherichia coli BL21(DE3)RIL. Byla otestována exprese rekombinantní gama-laktamasy a provedeny pokusy o její izolaci a stanovení aktivity.
Annotation in English
gama-laktamase is an enzyme, which can split five-membered lactam cycles. Polyvinylpyrrolidon (PVP) is a potential substrate of this enzyme. PVP is contained in wastewater, which is one of the reasons, why gama-lactamase is studied. The goal of this work is to prepare a bacterial expression systems of recombinant gama-lactamase. A gene of gama-lactamase was synthesized earlier. PCR was performed with primers containing C-terminal His-tag and restriction sites for cloning . PCR product was isolated and inserts were cleaved by restriction endonucleases and ligated by DNA ligase to the vector pET22b and pUC19. Competent bacterial cells Escherichia coli DH5-alpha were transformed with these vectors. Presence of the insert was checked by cleavage by restriction endonucleases and the sequence was verified by sequencing analysis. Expression cells Escherichia coli BL21(DE3)RIL were transformed by expression plasmids containind the gene of the recombinant gama-lactamase. The expression of recombinant gama-lactamase was tested.
Keywords
gama-laktamasa, Polyvinylpyrrolidon, bakteriální expresní systém, aktivita
1. Proveďte literární rešerši na dané téma. 2. Navrhněte postup přípravy expresních systémů. 3. Proveďte příslušné experimenty. 4. Teorii, výsledky a diskuzi sepište v předepsané formě.
Research Plan
1. Proveďte literární rešerši na dané téma. 2. Navrhněte postup přípravy expresních systémů. 3. Proveďte příslušné experimenty. 4. Teorii, výsledky a diskuzi sepište v předepsané formě.
